Mecanismos Genéticos Moleculares en cáncer de mama

Gracias a los últimos avances de la biología celular y molecular, los eventos cruciales de la carcinogénesis, progresión tumoral y la metástasis, están siendo analizados a nivel molecular.

Los laboratorios de Biología Molecular pueden brindar una importante información predictiva y ayudar a guiar las maniobras terapéuticas.

Entre estos nuevos podemos citar:

* Amplificación y/o sobreexpresión de oncogenes

* Secreción aumentada de factores de crecimiento

* Índice de proliferación celular

* Ploidía

* Proteínas inducidas por los estrógenos

* Proteínas del stress y  Golpe de calor

* Expresión de moléculas relacionadas con la metástasis

Un nuevo mecanismo genético molecular es la interacción clave entre BRCA1 y una proteína llamada RHAMM (codificada por el gen HMMR). Estas dos proteínas actúan en un mecanismo molecular antes desconocido, que regula la polaridad de las células epiteliales. 

Los investigadores han demostrado que BRCA1 y RHAMM controlan el desarrollo normal de las células epiteliales de mama; si uno o ambos genes presentan mutaciones, el desarrollo normal de las células mamarias se altera de manera que aumenta el riesgo de que aparezca un tipo específico de tumor.

Vocabulario: 

- Carcinogénesis: Inducción del cáncer, es un proceso de múltiples etapas y cada una se relaciona con uno o mas eventos mutacionales, ocurriendo una acumulación de lesiones génicas y cambios epigenéticos las cuales pueden ser variables, pudiendose tratar como deleciones, traslocaciones y amplificaciones génicas.

- Metástasis: propagación de un foco canceroso a un órgano distinto de aquel en el que se inició.

- Ploidía: es el número de juegos completos de cromosomas en una célula biológica.

Referencias: 

http://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=f5ynXCz-zZcC&oi=fnd&pg=PA151&dq=mecanismos+geneticos+moleculares+para+cancer+de+mama&ots=AiY785rB6Z&sig=4bkYXCctGzXOVtM7SlIWifGZjZU#v=onepage&q&f=false

http://www.saludymedicina.org/oncologia/cancer-de-mama
http://www.biotechspain.com/assets_db/news/assets/image_103113859233.jpg
http://mexico.cnn.com/media/2010/10/20/tumor.jpg
http://enciclopedia.us.es/index.php/Carcinog%C3%A9nesis
http://es.wikipedia.org/wiki/Met%C3%A1stasis
http://es.wikipedia.org/wiki/Ploid%C3%ADa

Microarray en cáncer de mama

Utilizando el análisis de microarrays Affymetrix de captura por láser

La angiogénesis es esencial para el crecimiento de tumores sólidos, mientras que los perfiles moleculares de los vasos sanguíneos del tumor se han notificado a ser diferente entre los tipos de cáncer. Aunque actualmente las estrategias anti-angiogénicos disponibles están proporcionando alguna promesa para el tratamiento de algunos tipos de cáncer tal vez no sea sorprendente que, ninguno de los agentes anti-angiogénicos disponibles trabajen en todos los tumores. Por lo tanto, se requiere el descubrimiento de nuevos anti-angiogénicos objetivos, pertinentes para tipos individuales de cáncer.

Utilizando el análisis de MICROARRAYS DE AFFYMETRIX de láser capturados, se diferencia los vasos sanguíneos angiogénicos asociados al carcinoma ductal invasivo (IDC) de la mama, en comparación con los vasos sanguíneos de los pacientes con cáncer de mama.

Microarray experimentos

ARN de las muestras LCM se amplificó utilizando el WT (transcriptoma entero) que es un sistema de amplificación de ARN (2 ciclos), y el ADNc fue fragmentado y marcado utilizando el Módulo FL-Ovation  de ADNc. A pesar de 2 ciclos de amplificación puede introducir un sesgo más de un ciclo, tuvimos cuidado en el control de esta amplificando tanto el cáncer y las muestras normales de forma idéntica.
Etiquetados ADNc microarray,  se realizaron en hibridaciones HG-U133 Plus 2 arrays (Affymetrix) y datos de expresión génica se analizó utilizando Bioconductor 2,2 se ejecuta en R2.7.1.
Medidas normalizadas expresión probeset se calcularon usando el  paquete 'Affy' robusto promedio multichip (RMA) método por defecto. La expresión génica diferencial entre grupos se evaluó duplicadas utilizando un Bayes empírico t-test como se aplica en el paquete 'limma'. Los valores resultantes se ajustaron para múltiples pruebas usando la Tasa de Falso Descubrimiento (FDR)
Los datos de Affymetrix se analizaron con el software Ingenuity Pathways Analysis
El análisis adicional de Microarray se realizó sobre muestras de xenoinjertos humanos U87 (Métodos S1).

Vocabulario:

ARNsi: Es el ARN pequeño de interferencia

ADNc: Es el ADN complementario

Referencias:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3462779/

http://farm9.staticflickr.com/8014/7368185910_19626ca62b_b.jpg

PCR en cáncer de mama

El objetivo de la PCR fue determinar la prevalencia de la mutación 185delAG.

Extracción de DNA de sangre periférica

Análisis de la mutación 185delAG: Para detectar la mutación 185delAG se utilizó la técnica de un mismatch PCR que es un método para la detección de una mutación puntual que no produce ni destruye un sitio de restricción; utiliza primers o cebadores para complementar la secuencia del ADN. El ADN amplificado mutante (a diferencia de la amplificación de ADN normal), cuando se digiere con endonucleasas apropiadas, electroforesis y se sondeó con un oligonucleótido marcado apropiado, revela un nuevo fragmento, menor restricción. Alternativamente, los primers o cebadores de PCR mismatch pueden ser diseñados para crear un nuevo sitio de restricción con el ADN normal, pero no con el ADN mutante.
La técnica usada genera dos bandas de 150pb y de 20pb para el alelo normal y solo una de 170pb para el alelo mutado, pues la enzima de restricción no corta el producto amplificado si esta presente la mutación.

La confirmación de la mutación 185delAG fue realizada por:

1. Amplificación por PCR del Exon 2 del Gen BRCA1 y Electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida

2. Hibridación alelo específica: consiste en los siguientes pasos:

a) Transferencia del  DNA a soporte sólido mediante la técnica de Dot Blotting
b) Marcación del oligonucleótido en el extremo 3'OH con digoxigenina-11-dd UTP
c) Hibridación de los filtros con el oligonucleótido marcado con digoxigenina-11-dd UTP
d) Detección de la hibridación mediante quimioluminicencia

3. Secuenciación directa

Vocabulario:

- Buffer: También llamado tampón químico; es un sistema constituido por un ácido debil y su base conjugada; o por una base y un ácido conjugado que tiene la capacidad de tamponante, es decir, que puede oponerse a grandes cambios de pH en una disolución acuosa.
- Oligonucleótido: secuencia corta de DNA o RNA, con 50 pares de bases o menos
- pb: pares de bases

Referencias:
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-98872002001000005
http://www.scielo.cl/fbpe/img/rmc/v130n10/img05-01.gif

http://www.scielo.cl/fbpe/img/rmc/v130n10/img05-02.gif
http://es.wikipedia.org/wiki/Buffer
http://es.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotido

Toma de muestra para técnicas de biología molecular de cáncer de mama

La biopsia selectiva del ganglio centinela (BSGC), es la técnica mas adecuada en la estadificación regional del cáncer de mama.

Se considera como ganglio centinela (GC) desde el punto de vista de la gammagrafía a aquel o aquellos que presentan migración desde el tumor mediante un canal linfático o ante la  no evidencia de dicho canal, aquel o aquellos que aparecen en uno o varios territorios de drenaje linfático.

Se consideran ganglios centinelas secundarios a aquellos que presentan una captación del trazador con menor intensidad claramente diferenciada

Se consideran como ganglios centinela con el trazador isotrópico, en el acto quirúrgico  aquel que presenta una actividad representativa y que esta ubicado en el área preseleccionada gammagraficamente
y se considera secundario aquel que tenga menos del 10% de la máxima actividad

En la intervención se define como ganglio centinela con el colorante todo ganglio que aparezca teñido de azul o al que fluye un conducto linfático azulado.

En la actualidad la aplicación de técnicas de biología molecular (PCR) debe realizarse solo en un marco de investigación.

Referencias: 
http://www.elsevier.es/sites/default/files/elsevier/pdf/36/36v82n03a13109517pdf001.pdf
http://lamordida.net/wp-content/uploads/2011/08/ganglios.jpg